Otimização de Técnicas Moleculares: estudo do Impacto da Temperatura e Humidade na Identificação de Estrongilídeos Gastrointestinais em Pequenos Ruminantes

Abstract

Introdução e Objetivos: O aumento da resistência aos anti-helmínticos ameaça a sustentabilidade deste setor de produção. Urge implementar estratégias de controlo focadas na manutenção da fauna parasitária e desparasitação seletiva, reduzindo a pressão de seleção. Além disso, os métodos atuais de diagnóstico de infeções por estrongilídeos gastrointestinais exigem recolha e processamento rápido de fezes frescas. As técnicas moleculares surgem como solução promissora, simplificando o diagnóstico e a logística associada. Este estudo tem como objetivo avaliar a viabilidade de um possível diagnóstico diretamente a partir de amostras fecais, por PCR convencional, testando o efeito da temperatura e da humidade de preservação das amostras. Metodologias e Resultados: Inicialmente, utilizaramse diferentes metodologias para avaliar quanto à capacidade de extração de DNA genómico de fezes recolhidas a fresco e larvas infetantes (L3) obtidas por coprocultura (controlo), provenientes de cabras e ovelhas desparasitadas há mais de três meses: DNeasy Blood & Tissue e PowerSoil (Qiagen), Chelex (Biorad). Para avaliar o impacto da temperatura e da humidade das amostras na extração de DNA genómico, as amostras foram mantidas à temperatura ambiente ou refrigeradas a 4°C durante 24 horas, subdivididas, calcadas em papel de filtro (3mm) e desidratadas na estufa a 25°C durante 16 horas ou mantidas frescas. Em todas as condições, foi possível extrair DNA genómico, amplificar uma porção do gene ITS1 do rRNA (Internal Transcriber Spacer) e identificar os géneros parasitários predominantes por sequenciação direta. Por clonagem em plasmídeo,transformação em células E. coli e sequenciação foi possível confirmar a presença de outros géneros nas amostras. Os resultados demonstraram que a desidratação das amostras na estufa foi essencial para a amplificação do gene ITS1 (rRNA), independentemente da temperatura de armazenamento. Sugerindo que o nível de humidade possa ser um fator crítico para o sucesso da técnica. Principais Conclusões: Os dados obtidos mostram ser possível identificar os géneros parasitários mais abundantes quer em amostras de fezes ou de larvas infetantes após sete dias de coprocultura. Apesar da análise direta de fezes proporcionar resultados mais rápidos, a sua interpretação pode ser dificultada pela prolificidade variável entre géneros parasitários. A temperatura não parece ser um fator determinante para a identificação de estrongilídeos gastrointestinais. Contudo, a redução da humidade parece ser essencial para o sucesso da amplificação, um passo crítico no processo de diagnóstico. O papel de filtro permite rapidez e fácil implementação, o que sugere a viabilidade de aplicação em campo.